sábado, 4 de noviembre de 2017

II Jornada UCM-SEV de Sensibilización al VIH/Sida



  ¡Queridos lectores! Esta entrada relata la II Jornada que realizaron los estudiantes del Máster en Virología el pasado 1 de Diciembre de 2016. ¡¡¡Solamente puedo decirles a por la siguiente!!!

  La II Jornada, apoyada por la Sociedad Española de Virología (SEV), la Facultad de Veterinaria de la Universidad Complutense de Madrid (UCM) y con la colaboración de la ONG Apoyo Positivo, se organizó por Ismael Román Moreno, exalumno del Máster en Virología, y el alumnado del presente curso del Máster, además de estudiantes, procedentes de otras carreras universitarias, que quisieron apoyar la causa y ser voluntarios.

  Este año se contó con un total de 155 asistentes. Este rotundo éxito se debe al formato de la Jornada que tiene como objetivo de informar a los jóvenes universitarios de la importancia del VIH, vías de infección, síntomas y sobre todo medidas de protección. Además de focalizarse en la erradicación de la estigmatización que sufren las personas infectadas por el virus.

  La conferencia bajo el título “Terapia contra el VIH y mecanismos de resistencia a fármacos antirretrovirales” impartida por el Dr. Luis Menéndez Arias (investigador del Centro de Biología Molecular “Severo Ochoa”) e info-sesiones de dos alumnos del Máster, Enrique Sapena Ventura y Almudena Náñez Cabrero, dejaron al auditorio sorprendido, boquiabierto y con la curiosidad a flor de piel. Se realizó un concurso a través de la app Kahoot! sobre la información recibida. Se premiaron las mejores puntuaciones con el libro Relatos Microscópicos, tres ejemplares cedidos por la Dra. Esperanza Gómez Lucía-Duato, coordinadora del Máster.

  Se realizó un taller gracias a la colaboración de la ONG Apoyo Positivo, impartido por Clara Castillo González y Beatriz Parejo Martín, en el que se abordó detalladamente el diagnóstico de las pruebas rápidas de detección del VIH. En el cine fórum se abordaron, mediante pequeños fragmentos de vídeos, diferentes perspectivas (sanitaria y social) de los aspectos actuales de esta gran pandemia.


  La Jornada culminó con una magnífica representación teatral, escrita y dirigida por Sara Arroyo Moreno alumna del Máster e interpretada por alumnos/as. Con ello se dio paso al acto de clausura y punto álgido, momento en el que se entregaron los premios del concurso y sorteo, así como los certificados de asistencia a los alumnos del Máster.

Por: Ismael Román Moreno, exalumno del Máster en Virología - Universidad Complutense de Madrid

martes, 24 de octubre de 2017

Abejas... ¡nuestro bien más preciado!



 ¡Queridos lectores! No nos olvidamos de vosotros... así que poneros las gafas, acercaros a la pantalla y, espero que os guste la siguiente lectura!!

La polinización es vital para que las plantas con flor produzcan semillas y frutos. Las abejas son las polinizadoras por excelencia, son las responsables de hasta aproximadamente el 90%. Y ya lo decía Albert Einstein: "Sin abejas no hay polinización, ni hierba, ni animales, ni hombres..."

Las abejas melíferas pueden padecer varias enfermedades debido a la acción de diferentes organismos patógenos como son los ácaros, hongos, protozoos y artrópodos entre otros. En este monográfico vamos a profundizar en los virus como parásitos intracelulares obligados precursores de una de las mayores causas de mortandad de las abejas (Bromenshenk et al., 2010).

   Las colmenas han proporcionado a los hombres miel, cera, polen, propóleo y jalea real desde hace mucho tiempo. Este uso comercial ha desarrollado la industria de la apicultura. Además un beneficio de la actividad de pecoreo es la polinización. Las abejas son los polinizadores más importantes de las magnoliófitas (Cavigli et al., 2016).

   Menos conocido es el hecho de que las abejas secretan un veneno, la apitoxina, que se emplea en medicina como apiterapia, ya que tiene propiedades antiinflamatorias, suprime el dolor y corrige los ataques de anticuerpos hacia las articulaciones (Carrillo-Tripp et al., 2016). Se utiliza como tratamiento complementario o alternativo para el alivio sintomático el reumatismo y la esclerosis múltiple. Además la melitina puede destruir el virus del VIH mediante unos agujeros en la envoltura (Kouros, 2013).

   En el año 1933 se citó por primera vez en la Isla de Wight (sur de Inglaterra), una enfermedad que producía gran mortandad en abejas. Tras numerosas investigaciones se observó que el causante era el virus de la parálisis crónica (VPC) (Carrillo-Tripp et al., 2016).

   En la Tabla 1 se puede observar la gran diversidad de familias víricas especializadas en parasitar todo tipo de insectos (himenópteros, coleópteros y dípteros).

 Tabla 1: Clasificación de los principales virus que infectan a insectos. Adaptado Caballero et al., Phytoma. (2008).

   Los virus que pueden infectar a las abejas, así como la familia a la que pertenecen, la simetría de su cápside y el tipo de material genómico que porta se muestran en la Tabla 2

Tabla 2: Clasificación de los virus de abejas.  Adaptado Genersch et al., 2010.

   No existen drogas antivirales específicas ni vacunas, pero trabajos experimentales han demostrado que tanto la oxitetracilina como el azúcar común (sacarosa) inhiben el desarrollo del virus. Una opción sería dar alimentación artificial mediante un jarabe que contenga 300 mg de sal pura de oxitetraciclina. También se pueden usar pesticidas y fungicidas que maten a ácaros (Varroa), hongos, etc., que actúan como vectores (Carrillo-Tripp et al., 2016).

   Algunas medidas preventivas incluyen el manejo correctivo, recambio de reinas ya que después de los dos años de vida disminuye su capacidad para poner huevos, además reacciona tarde a la llegada de la primavera con respecto el resto de colmenas siendo esta menos prolífica. Otras medidas son, un mayor espacio para que la reina pueda aovar con lo que se contribuye con un rápido crecimiento de la colmena, reemplazo de cuadros ya que muchas veces pueden quedar saturados por el polen, y por último, el control de otras enfermedades (amebiasis, nosemosis, loque).

   Es importante saber que Varroa destructor actúa en muchos casos como un vector transmisor, o activador de estos agentes virales, por ejemplo, si Varroa realiza una punción a una abeja sana, producirá como lesión un orificio a través del cual pueden penetrar virus. Otra singularidad importante a destacar es la ausencia de tratamientos efectivos, aunque las abejas tienen un sistema inmune que las protege y defiende. Finalmente resaltar dos aspectos importantes de las virosis: (1) las poblaciones de virus en las colonias varían a lo largo del año y (2) algunas enfermedades víricas se manifiestan solamente cuando otro agente patógeno desencadena su acción.

   Actualmente se sabe que en muchos casos las abejas de las colonias pueden estar infectadas por más de un virus. No hay mucha información sobre estas coinfecciones múltiples y hay muchas preguntas que esperan de una contestación adecuada, por ejemplo, ¿qué virus están presentes de forma latente o inaparente?, ¿compiten de alguna forma entre ellos?, ¿potencian unos la acción de otros?, ¿cómo interaccionan?...Todas estas preguntas necesitan respuestas urgentes para garantizar que las poblaciones de abejas no sufren disminución. ¡Ellas son clave para el futuro!

Lecturas relaccionadas:
  • Bromenshenk JJ, Henderson CB, Wick CH, Stanford MF, Zulich AW, Jabbour RE, Deshpande SV, McCubbin PE, Seccomb RA, Welch PM, Williams T, Firth DR, Skowronski E, Lehmann MM, Bilimoria SL, Gress J, Wanner KW, Cramer RA J. 2010. Iridovirus and microsporidian linked to honey bee colony decline. PLos One. 5(10):e13181.
  • Carrillo-Tripp J, Dolezal AG, Goblirsch MJ, Miller WA, Toth AL, Bonning BC.2016. In vivo and in vitro infection dynamics of honey bee viruses. Sci Rep. 6:22265.
  • Cavigli I, Daughenbaugh KF, Martin M, Lerch M, Banner K, Garcia E, Brutscher LM, Flenniken ML. 2016. Pathogen prevalence and abundance in honey bee colonies involved in almond pollination. Apidologie. 47:251-266.
  • Genersch E. Aubert M. 2010. Emerging and re-emerging viruses of the honey bee (Apis mellifera L.) Vet. Res. 41:54
  • Kouros N. 2013. New research finds HIV can be killed with bee venom. Monash Bioeth Rev.31(2):4

Por: Ismael Román Moreno, Máster en Virología - Universidad Complutense de Madrid




viernes, 27 de enero de 2017

¡Señores y señoras ha llegado, es una realidad y se llama: CRISPR/Cas!

De qué mejor manera se manera se puede comenzar este año 2017 que hablando de la la novedosa tecnología CRISPR/Cas; de un sistema inmune adaptativo contra fagos a una revolución en la ingeniería genética.... ¿Quieres saber más? Andoni Gómez Moreno, estudiante del Máster en Virología, nos deleitará en los siguientes renglones... ¡a por ellos! =)

A lo largo de la historia determinados descubrimientos permiten el desarrollo de nuevas técnicas que facilitan nuestro día a día. Nos proporcionan un bien o un servicio, curan enfermedades o permiten el diseño de nuevos experimentos. Este último ejemplo fue el caso de las enzimas de restricción descubiertas por Werner Arber en 1968 que condujeron al desarrollo del DNA recombinante o la PCR desarrollada por Kary Mullis en 1986, que es una de las técnicas de biología molecular más utilizadas en cualquier laboratorio. Ambos científicos fueron galardonados con el Premio Nobel de Fisiología o Medicina en 1978 y Premio Nobel de Química en 1993. Con apenas casi 5 años desde su descubrimiento la tecnología CRISPR/Cas no solamente ha estado a punto de ser galardonada con el Premio Nobel sino que cada día existen más laboratorios que la utilizan como técnica de rutina para la edición genómica. En esta publicación pretendemos mostrar los principios básicos de esta tecnología así como su origen y su uso en el laboratorio.

Un sistema CRISPR/Cas es un mecanismo de defensa que poseen las bacterias frente a la invasión de bacteriófagos. Cuando un fago inyecta su DNA en la bacteria hospedadora, esta bacteria incorpora fragmentos del DNA de dicho fago en su genoma en un locus determinado denominado CRISPR, Clustered Regularly Interspaced short Palindromic Repeats, término acuñado por el investigador español Francis Mojica (Mojica et al., 2005). Posteriormente en una segunda infección del mismo fago, la bacteria expresa una serie de RNAs, entre ellos un crRNA, que dirigen el corte de una endonucleasa en el DNA del nuevo fago invasor, degradando dicho DNA, lo que confiere resistencia a la bacteria frente a esta segunda infección (Mojica et al., 2009)
Figura 1: Mecanismo de defensa inmune adaptativo de bacterias frente a virus. Imagen de elaboración propia.

En una infección primaria el DNA del fago que posee una secuencia PAM (Representada en amarillo) es reconocida por distintas proteínas del sistema CRISPR y es procesado para posteriormente insertarse en el locus CRISPR. En una segunda infección se expresa una endonucleasa Cas y un RNA (pre-crRNA) a partir del DNA anteriormente insertado en el locus CRISPR. El pre-crRNA se procesa, se ensambla el complejo ribonucleoproteico y corta el DNA del segundo fago confiriendo a la bacteria inmunidad (Mojica et al., 2009, 2005) (Figura 1). Algunos sistemas CRISPR, como por ejemplo el sistema CRISPR de tipo II codifican un RNA adicional denominado tracrRNA que es complementario en una región a todos los crRNAs. En 2012 Jinek combinó el crRNA y el tracrRNA con el fin de generar un único RNA que sirviera como guía generando una endonucleasa programable por RNA (Jinek et al., 2012). El doctor Mojica humildemente reconoce es que nunca imaginó que su descubrimiento fuera a dar lugar a una de las técnicas más importantes de los últimos años. Con más de 4000 artículos publicados con la palabra CRISPR en 2016 en la base de datos Scopus de Elsevier, está técnica permite a investigadores de todo el planeta una modificación genética eficaz, precisa, selectiva y de fácil diseño, prácticamente impensable hace apenas unos años.

El éxito de esta técnica radica en las endonucleasas Cas, que realizan un corte en ambas hebras del DNA conocido como double strand break (DSB). Lo que realmente hace interesante a esta enzima es su dominio de unión a DNA. Este dominio de unión a DNA se caracteriza por asociarse a un RNA que determina su especificidad. Por lo tanto, con el fin de generar un DSB en un lugar concreto del genoma de un individuo basta con modificar la secuencia del RNA asociado a esta proteína, programándola para que sea complementaria con la región dentro del genoma que queremos modificar (Jinek et al., 2012) (Figura 2).
Figura 2: Mecanismo de corte de Cas9. Imagen de elaboración propia.

Una vez se produce el DSB, la célula lo reconoce como un daño en el DNA que puede reparar esencialmente de dos maneras. Por lo general, de forma muy resumida puede unir los extremos separados mediante la acción de ligasas, fenómeno que es muy susceptible a la pérdida de ciertas pares de bases del DNA, o puede realizar recombinación con secuencias de alta similitud. La primera vía conocida como Non-Homologous End Joining (NHEJ) permite la disrupción de genes ya que si dirigimos el DSB de Cas9 hacia un marco de lectura abierto que da lugar a una proteína, lo normal es que se pierdan ciertas pares de bases y valga la redundancia se pierda el marco de lectura y con él la proteína. Por otra parte, si forzamos un fenómeno de recombinación introduciendo un tercer elemento en el que se encuentre un gen de interés, estaremos introduciendo nuestro gen de interés en la región del genoma en la que previamente habíamos generamos el DSB (Seruggia and Montoliu, 2014) (Figura 3).

 
Figura 3: Mecanismos principales de reparación del DNA. Imagen de elaboración propia.

Existen distintos tipos de sistemas CRISPR que se clasifican en dos clases en función del número de endonucleasas y posteriormente en distintos tipos y subtipos. La clase 1 engloba los tipos I, III y IV que utilizan múltiples endonucleasas para realizar el corte, mientras que la clase 2 (tipos II,V y VI) utilizan una única endonucleasa Cas. El sistema CRISPR/Cas más utilizado es el sistema CRISPR/Cas de tipo II cuya endonucleasa se denomina Cas9 (Nishimasu and Nureki, 2017).

Como hemos mencionado anteriormente se trata de un sistema selectivo y de fácil diseño. En primer lugar hay que destacar que no es posible seleccionar todas las secuencias dentro de un genoma, esto es debido a que para que la endonucleasa se una a una secuencia determinada y la corte de forma eficiente esta tiene que estar aguas arriba de otra secuencia de 2-6 nucleótidos denominada PAM. En el caso de la endonucleasa Cas9 el PAM tiene una longitud de 3 nucleótidos (Mojica et al., 2009). Sabemos que el DNA está formado por Adenina, Guanina, Citosina y Timina con lo cual la probabilidad de que el PAM de Cas9 de tres nucleótidos aparezca a lo largo del genoma es de 0,25 x 0,25 x 0,25 = 0,015625. Esto significa que cada 64 nucleótidos por estadística aparece una secuencia PAM de 3 nucleótidos. Una proteína pequeña como la ubicuitina de 76 aminoácidos y de 8,5 KDa como mínimo sería expresada a partir de un gen de 228 nucleótidos. Esto significa que estadísticamente existen 3,5625 sitios de corte en uno de los genes más cortos. De tal forma que a pesar de que no es posible realizar un corte en cualquier nucleótido dentro de un genoma, es posible realizar más de un corte dentro de cada uno de los genes de un genoma, en otras palabras es muy poco probable que un gen no posea una secuencia PAM y por lo tanto no pueda ser cortado. Llegados a este punto uno se plantearía que dado que la secuencia PAM está presente por probabilidad a lo largo del genoma, este sistema sería muy poco específico. Sin embargo Cas9 actúa únicamente cuando en el DNA existe una alta complementariedad con el RNA que guía a Cas9. Esta complementariedad es de 20 nucleótidos. Como en el cálculo para la probabilidad del PAM, la probabilidad de que una secuencia de 20 nucleótidos esté presente en un genoma es de 9,095 x 10-13. Teniendo en cuenta que el genoma humano tiene 3 x 10 9 pares de bases esto significa que una secuencia de 20 nucleótidos seleccionada al azar aparecería 2,7285 x 10-3 veces. Por todo ello, el sistema no solo hace permite cortar prácticamente cualquier gen sino que lo hace de forma muy específica.

Con el fin de diseñar nuestro RNA guía existen distintas herramientas bioinformáticas. El programa del MIT (http://crispr.mit.edu/) es una de las más utilizadas. Como datos de entrada seleccionamos de la base de datos el genoma junto con la secuencia del gen (Fragmento de hasta 250 nucleótidos) (Figura 4).

Figura 4: Información solicitada por el programa de diseño de RNAs guía del MIT.
 
En un primer momento el programa lo que realiza es detectar los PAM presentes en el fragmento del gen que hemos introducido y por lo tanto los distintos RNAs guía posibles para esta secuencia. Posteriormente lo que realiza es valorar cada uno de los RNAs y les asigna un valor. Este valor es asignado en función de la probabilidad de que el RNA guía  valorado pudiera hacer objetivo a otro gen dentro del genoma. Es decir el programa analiza la presencia de la secuencia de 20 nucleótidos del RNA guía en el resto del genoma. Como hemos mencionado la posibilidad de la presencia de esta secuencia a lo largo del genoma es muy baja, sin embargo es posible que aunque la complementariedad de las 20 pares de bases entre el RNA guía y el DNA no sea del 100% la endonucleasa actúe. El programa contempla esta posibilidad y lo que hace es asignar un valor alto a los RNAs guía cuya probabilidad de complementar con otras secuencias dentro del genoma sea mínima. Todo ello se recoge en la figura 5 y se explica en la página web http://crispr.mit.edu/about

Figura 5: Diseño de RNAs guía en proceso en el programa de diseño de RNAs guía del MIT.

Existe un programa desarrollado en el Centro Nacional de Biotecnología del Consejo Superior de Investigaciones Científicas (CNB-CSIC) denominado Breaking Cas (http://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/breakingcas/) que nos permite seleccionar genomas de otros organismos (Oliveros et al., 2016).

A lo largo de este artículo estamos hablando de cortar el DNA en una región específica dentro de un genoma sin embargo existen otras muchas aplicaciones del sistema. De forma muy simplista podemos decir que la endonucleasa Cas9 tiene 2 tipos de dominios: Los dominios de unión al RNA guía y DNA y los dominios de corte. Los dos dominios de corte (RuvC y HNH) de la endonucleasa Cas9 son similares a los dominios de corte de una endonucleasa convencional. Lo que hace singular a esta endonucleasa es su dominio de unión al RNA guía y DNA que se une de forma específica a una secuencia dentro del genoma (Nishimasu et al., 2014). De esta manera por ejemplo podemos mutar uno de los dominios de corte de Cas9 y generar en lugar de un corte únicamente en una de las dos hebras del DNA, en inglés generar un SSB (Single Strand Break) en lugar de un DSB (Luo et al., 2016). Por otro lado se han intercambiado mediante ingeniería genética los dos dominios de corte de Cas9 por proteínas que realizan distintas  modificaciones químicas en el DNA como los reguladores de la cromatina (Tadi et al., 2016). Esto permite modificar los patrones epigenéticos de forma específica.

Hoy en día se están estudiando nuevos tipos de sistemas CRISPR/Cas que ofrecen ventajas y otras utilidades en la edición genómica (Brouns et al., 2014; Zetsche et al.,). Ya hay publicaciones en las que escinden el VIH-1 integrado en linfocitos T CD4+ in vitro (Kaminski et al., 2016) y la generan antimicrobianos específicos de secuencia contra bacterias multi-resistentes vehiculizaos a través de fagos (Bikard et al., 2014; Citorik et al., 2014).

En definitiva el sistema CRISPR/Cas ha revolucionado el mundo de la edición genómica permitiendo realizar modificaciones de una forma específica y efectiva abriendo un mundo de nuevas posibilidades cuyo único límite es nuestra imaginación. 

Lecturas relacionadas:

  • Bikard, D., Euler, C.W., Jiang, W., Nussenzweig, P.M., Goldberg, G.W., Duportet, X., Fischetti, V.A., Marraffini, L.A., 2014. Exploiting CRISPR-Cas nucleases to produce sequence-specific antimicrobials. Nat. Biotechnol. 1–6. doi:10.1038/nbt.3043
  • Brouns, S.J.J., Oost, J. Van Der, Hb, Δ., 2014. DNA-guided DNA interference by a prokaryotic Argonaute. doi:10.1038/nature12971
  • Citorik, R.J., Mimee, M., Lu, T.K., 2014. Sequence-specific antimicrobials using efficiently delivered RNA-guided nucleases. Nat. Biotechnol. 1–7. doi:10.1038/nbt.3011
  • Jinek, M., Chylinski, K., Fonfara, I., Hauer, M., Doudna, J.A., Charpentier, E., 2012. A Programmable Dual-RNA – Guided DNA Endonuclease in Adaptive Bacterial Immunity. Science (80-. ). 337, 816–822. doi:10.1126/science.1225829
  • Kaminski, R., Chen, Y., Fischer, T., Tedaldi, E., Napoli, A., Zhang, Y., Karn, J., Hu, W., Khalili, K., 2016. Elimination of HIV-1 Genomes from Human T-lymphoid Cells by CRISPR / Cas9 Gene Editing. Nat. Publ. Gr. 1–15. doi:10.1038/srep22555
  • Luo, M.L., Leenay, R.T., Beisel, C.L., 2016. Current and future prospects for CRISPR-based tools in bacteria 113, 930–943. doi:10.1002/bit.25851.Current
  • Mojica, F.J.M., Díez-Villaseñor, C., García-Martínez, J., Almendros, C., 2009. Short motif sequences determine the targets of the prokaryotic CRISPR defence system. Microbiology 155, 733–740. doi:10.1099/mic.0.023960-0
  • Mojica, F.J.M., Díez-Villaseñor, C., García-Martínez, J., Soria, E., 2005. Intervening sequences of regularly spaced prokaryotic repeats derive from foreign genetic elements. J. Mol. Evol. 60, 174–182. doi:10.1007/s00239-004-0046-3
  • Nishimasu, H., Nureki, O., 2017. Structures and mechanisms of CRISPR RNA-guided effector nucleases. Curr. Opin. Struct. Biol. 43, 68–78. doi:10.1016/j.sbi.2016.11.013
  • Nishimasu, H., Ran, F.A., Hsu, P.D., Konermann, S., Shehata, S.I., Dohmae, N., Ishitani, R., Zhang, F., Nureki, O., 2014. Crystal structure of Cas9 in complex with guide RNA and target DNA. Cell 156, 935–949. doi:10.1016/j.cell.2014.02.001
  • Oliveros, J.C., Franch, M., Tabas-Madrid, D., San-León, D., Montoliu, L., Cubas, P., Pazos, F., 2016. Breaking-Cas—interactive design of guide RNAs for CRISPR-Cas experiments for ENSEMBL genomes. Nucleic Acids Res. 44, gkw407. doi:10.1093/nar/gkw407
  • Seruggia, D., Montoliu, L., 2014. The new CRISPR-Cas system: RNA-guided genome engineering to efficiently produce any desired genetic alteration in animals. Transgenic Res. doi:10.1007/s11248-014-9823-y
  • System, C.C., Zetsche, B., Gootenberg, J.S., Abudayyeh, O.O., Regev, A., Koonin, E. V, Zhang, F., Pam, T., Zetsche, B., Gootenberg, J.S., Abudayyeh, O.O., Slaymaker, I.M., n.d. Cpf1 Is a Single RNA-Guided Endonuclease of a Article Cpf1 Is a Single RNA-Guided Endonuclease of a Class 2 CRISPR-Cas System. Cell 163, 759–771. doi:10.1016/j.cell.2015.09.038
  • Tadi, V., Bo, L., Vojta, A., Dobrini, P., Kora, P., Zoldo, V., Julg, B., Klasi, M., 2016. Repurposing the CRISPR-Cas9 system for targeted DNA methylation 1–14. doi:10.1093/nar/gkw159

Por: Andoni Gómez Moreno, Máster de Virología - Universidad Complutense de Madrid